| 如何保證發(fā)酵無菌系統(tǒng)
一、優(yōu)化設(shè)計發(fā)酵工藝及設(shè)備
空氣系統(tǒng)的處理設(shè)計
據(jù)文獻(xiàn)資料統(tǒng)計，城市中每立方米空氣中含細(xì)菌數(shù)就多達(dá)103—104個，空氣帶菌導(dǎo)致發(fā)酵失敗的幾率高達(dá)20％左右。因此進(jìn)入發(fā)酵系統(tǒng)前空氣必須進(jìn)行除菌處理，對于好氣性發(fā)酵更應(yīng)重視空氣系統(tǒng)�？諝庀到y(tǒng)設(shè)計應(yīng)該注意的問題有以下幾點：
①盡量改善采風(fēng)口的環(huán)境，主要辦法有：采風(fēng)口選址在上風(fēng)口，通風(fēng)較好處；減少空氣循環(huán)次數(shù)；提高采風(fēng)口高度，目前已有企業(yè)升至35m以上；盡量加大排氣口與采風(fēng)口的距離，并采用濾袋、噴膠棉等介質(zhì)對空氣進(jìn)行預(yù)過濾。
②選用螺桿式空壓機，減少油分進(jìn)入空氣系統(tǒng)，提高空氣壓縮后的溫度（可達(dá)120℃以上），并保持較長的時間，這對殺菌也有一定的效果。壓縮空氣經(jīng)過二級冷卻器后的溫度必須低于露點，保證油水分離設(shè)備的分離效果。在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，南方空氣潮濕地區(qū)冷卻后的溫度應(yīng)降到16—18℃，北方干燥地區(qū)可高些。
③空氣進(jìn)入總過濾器及終端過濾器之前還需經(jīng)過加熱程序，目前使用較廣泛的聚四氟乙烯膜過濾器具有除菌效率高（可達(dá)99．9999％）的優(yōu)良性能，可過濾0.01μm的顆粒，能濾除全部細(xì)菌和噬菌體(細(xì)菌最小直徑為0.3μm，噬菌體直徑約0.02μm)。但其使用要求也較高，首先是相對濕度要控制在60％以下，主要方法就是提高壓縮空氣的溫度至50℃以上，最高可達(dá)65℃左右。為了減少壓縮空氣加熱溫度的波動，可考慮安裝蒸汽壓力自控系統(tǒng)，以提高加熱蒸汽壓力的穩(wěn)定性。其次過濾器的滅菌和使用也要十分注意。過濾器滅菌時，首先要將蒸汽的冷凝水排清。其次是要控制好過濾器的蒸汽壓力和消毒時間（一般控制在0.1—0.12MPa，30min）；最后要徹底將濾芯吹干，否則容易造成濾芯過濾失效，所以過濾器的滅菌最好安排在發(fā)酵罐空消之前進(jìn)行。在使用過濾器時，開啟閥門要緩慢打開，不宜過急，以防止空氣流速瞬間劇增而超過過濾器設(shè)計的空氣流速要求，從而保證過濾器的除菌效果。
④加強過濾系統(tǒng)，保證過濾系統(tǒng)的有效性。目前已有企業(yè)在各發(fā)酵罐進(jìn)氣前加入3道過濾器，以保證空氣的潔凈度。
設(shè)備的設(shè)計、制作和安裝
在設(shè)備設(shè)計、制作和安裝過程中，設(shè)法減少設(shè)備死角是提高滅菌質(zhì)量最為有效手段之一。由于設(shè)備制造商缺乏對發(fā)酵生產(chǎn)專業(yè)知識的了解，住往會出現(xiàn)許多人為原因造成設(shè)備死角的現(xiàn)象，以致設(shè)備在使用一段時間后出現(xiàn)許多問題。
選材方面
在罐體、閥門及罐內(nèi)裝置等選用不銹鋼作為材質(zhì)，可減少因出現(xiàn)銹斑而形成設(shè)備死角的問題；在發(fā)酵罐的設(shè)計和制作中可能出現(xiàn)以下問題：
①罐內(nèi)安裝加強板，一旦出現(xiàn)裂紋發(fā)酵液就會進(jìn)入加強板與罐壁之間形成的死角，造成滅菌不徹底；
②焊接質(zhì)量不好，如虛焊、明顯的沙孔等都易造成死角；
③螺桿與螺孔不匹配等（攪拌葉和聯(lián)軸器的固定）。上述三種現(xiàn)象，都容易積聚發(fā)酵培養(yǎng)基造成結(jié)垢，是發(fā)酵罐常見的設(shè)備死角。
管路的安裝和布置
發(fā)酵管路（特別是物料輸送的管路）閥門的安裝、布置較之普通管道或閥門的要求更高，更細(xì)，既不能有滲漏，又不能有滅菌死角。所以需要注意以下幾點：
①管道與管道進(jìn)行焊接時，管口之間要吻合(如走熟料的管道，管口要45℃倒角)，有利于管內(nèi)焊縫平整。
②盡可能減少彎頭的使用數(shù)量，管道轉(zhuǎn)彎時盡量使用制作彎管，以減少管道的焊口。
③管道與法蘭焊接時，必須要內(nèi)外兩面焊(必要時內(nèi)焊最好使用氬弧焊)，以保證焊口光滑，確保管道無死角。
④進(jìn)料管、出料管、移種管等物料管道，安裝布置時，必須要有2％的坡度；同時要避免出現(xiàn)U型或V型的管路布置，目的是要杜絕管道內(nèi)出現(xiàn)積液現(xiàn)象，防止滅菌不徹底。
⑤閥門(物料管道)與法蘭的密封墊圈最好使用聚四氟乙烯材料，且墊圈的口徑要以法蘭的口徑為準(zhǔn)(閥門的口徑為公稱尺寸，而法蘭為標(biāo)準(zhǔn)尺寸)，否則墊圈會滯留雜物，而形成滅菌死角。
⑥安裝閥門考克時，要安裝在閥腔的末端或最低位，確保蒸汽在閥腔內(nèi)的流通和冷凝水的排走暢順。
滅菌設(shè)備
培養(yǎng)基的滅菌方法一般有實消和連消兩種方法。實消方法分升溫和保壓兩個時間段，均要求必須控制溫度勻速上升，要經(jīng)常對各進(jìn)氣管進(jìn)行檢查，確保每路管道蒸汽暢通；保壓時發(fā)酵罐的罐壓應(yīng)達(dá)到0.1MPa以上，以確保發(fā)酵罐內(nèi)空間滅菌的效果。
目前應(yīng)用最廣泛的是低壓蒸汽噴射器的連消工藝，該工藝既可以提高培養(yǎng)基的滅菌效果，又可以節(jié)約大量的蒸汽和冷卻水。在實際生產(chǎn)中，可以根據(jù)不同發(fā)酵培養(yǎng)基的配比濃度，調(diào)整噴射器的滅菌溫度和維持罐的保壓時間。運用連消工藝主要注意下面幾個問題：
①在連消進(jìn)料初期，由于罐壓較高，容易造成溫度的波動，操作不當(dāng)會出現(xiàn)低溫料噴入維持罐的情況。如有這種情況，可以采取停進(jìn)料，保壓適當(dāng)時間或?qū)⒌蜏亓吓抛叩妊a救辦法進(jìn)行處理。
②在連消過程中因停電或輸送泵出現(xiàn)故障，造成噴射器不能入料時，蒸汽會將維持罐的穩(wěn)定液層打亂，造成物料的保壓時間達(dá)不到滅菌工藝要求。此時應(yīng)迅速關(guān)閉換熱器的冷卻水閥和維持罐的上出料閥，對罐內(nèi)的培養(yǎng)基進(jìn)行保壓滅菌。
③為了預(yù)防換熱片或管道、閥門出現(xiàn)滲漏，在進(jìn)行物料降溫時，要緩慢打開冷卻水閥門，以免因降溫速度過快產(chǎn)生負(fù)壓，抽吸外界空氣而造成雜菌污染。
設(shè)備應(yīng)急措施
在發(fā)酵設(shè)備的管道上，為了實現(xiàn)工藝能力，減少管線布置，會將多種不同管線串連在一起，以達(dá)到管線的高效使用。在這種情況下，需要在管道上加裝單向閥，以防止物料、水及蒸汽的倒流。同樣，由于潛在的停電風(fēng)險必然導(dǎo)致空氣系統(tǒng)停止供氣，氣體倒流致使發(fā)酵失敗。已經(jīng)有企業(yè)采取如在發(fā)酵排氣處加裝單向閥等應(yīng)急措施來為操作個人提供應(yīng)急時間。
二、發(fā)酵過程的染菌途徑及原因分析
發(fā)酵過程中常見的污染原因主要有空氣帶菌、培養(yǎng)基滅菌不徹底、設(shè)備死角、環(huán)境影響、人員操作等五個方面�？赡芪廴镜碾s菌有芽孢桿菌、短桿菌、長桿菌、球菌、噬菌體等。在大生產(chǎn)中，要十分準(zhǔn)確地找到污染源，難度極大。我們可以根據(jù)發(fā)酵污染雜菌的類型和時間，做出大概的判斷，盡量避免防止污染工作的無用功。
進(jìn)行污染原因分析時可以遵循以下的思路：
①發(fā)酵污染范圍較廣，其污染源可主要從公用系統(tǒng)去找，如種子系統(tǒng)、空氣系統(tǒng)、滅菌系統(tǒng)、補料系統(tǒng)、氨系統(tǒng)等。公用系統(tǒng)出現(xiàn)問題時均可能導(dǎo)致多個發(fā)酵罐同時污染。一個發(fā)酵罐污染的雜菌類型有多種時，這可能與種子罐接種時無菌操作失誤或設(shè)備出現(xiàn)滲漏倒吸有關(guān)。同一個罐連續(xù)污染，則應(yīng)重點檢查人員操作和罐內(nèi)死角。
②從污染雜菌類型分析，發(fā)酵污染粗大芽孢桿菌時，首先要考慮污染源可能來自培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底。如果是發(fā)酵前期污染，則首要考慮種子培養(yǎng)基問題或移種管路滅菌不徹底；
如果是發(fā)酵中后期污染，則首要考慮發(fā)酵培養(yǎng)基問題和發(fā)酵罐存在設(shè)備死角而滅菌不徹底；
污染嗜堿性粗短芽孢桿菌時，就要對氨系統(tǒng)進(jìn)行處理；
污染較細(xì)長的桿菌時，就應(yīng)考慮空氣過濾器問題。
③影響發(fā)酵污染的因素眾多，都與人的操作有關(guān)。發(fā)酵應(yīng)該盡量避免防污染工作走樣，必須時刻提醒員工嚴(yán)格按照SOP（標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序）操作不走樣。不管是什么原因造成污染，發(fā)酵全過程的操作人員必須及時進(jìn)行分析、總結(jié)，發(fā)現(xiàn)問題，制訂防范措施。
培養(yǎng)基的配制和滅菌操作
在發(fā)酵生產(chǎn)中，要殺滅99.999％嗜熱性芽孢桿菌，理論上要求121℃、15min，但實際發(fā)酵生產(chǎn)要求滅菌溫度和時間都明顯比理論值要提高或延長。發(fā)酵培養(yǎng)基中，如果有較多固形物存在，會對滅菌質(zhì)量造成很大的影響，如使用較普遍的玉米漿，其固形物是比較多的，使用時必須要經(jīng)過30目的篩網(wǎng)過濾，以除去顆粒較大的料渣。相對于一些比較難溶的培養(yǎng)基(如酵母粉、蛋白胨等)，必須要提前2小時進(jìn)行配料，確保培養(yǎng)基溶解充分，可增加過濾篩網(wǎng)把超過一定尺寸的顆粒去掉。需要指出的是，雜菌在攪拌的條件下會進(jìn)行加速繁殖，加大培養(yǎng)基滅菌的難度，所以對發(fā)酵用原材料也需要有一定的控制。
在生產(chǎn)中引人多通道電腦記錄儀，記錄培養(yǎng)基滅菌和發(fā)酵過程中的一些關(guān)鍵參數(shù)，對防污染工作分析也有很大的幫助。
設(shè)備的清洗
加強設(shè)備的清洗工作，是減少設(shè)備死角較為有效的措施之一，同時也能有效地防止有害微生物的孳生。不同的設(shè)備清洗周期有所不同，如種子罐、發(fā)酵罐等主要設(shè)備，待每批移種或放罐后必須用高壓水槍進(jìn)行清洗；
而一些罐內(nèi)結(jié)構(gòu)簡單的設(shè)備如配料罐、維持罐、換熱器等可以根據(jù)罐內(nèi)或板片的結(jié)垢情況，隨時進(jìn)行人工清洗或浸熱堿處理。閥門的清潔檢查同樣相當(dāng)重要，必須制訂嚴(yán)格的制度來保證閥門的拆檢。特別是經(jīng)常接觸物料的閥門，其閥芯與閥桿的連接處，最容易積垢，以致閥芯轉(zhuǎn)動不靈活或鎖死而造成死角或浸漏。
做好環(huán)境衛(wèi)生和發(fā)酵無菌驗證
除了以上幾個因素外，發(fā)酵車間的環(huán)境也是一個不可忽視的環(huán)節(jié)。加強環(huán)境衛(wèi)生和環(huán)境消毒，可以最大程度地降低雜菌對發(fā)酵污染的威脅。從雜菌檢測中可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐周圍的環(huán)境是比較惡劣的，其雜菌的類型及數(shù)量比較多，如果在日常操作過程中某一個環(huán)節(jié)出錯(如接種時或發(fā)酵過程中設(shè)備滲漏出現(xiàn)負(fù)壓等)，都會給發(fā)酵成污染和經(jīng)濟(jì)損失。要消除環(huán)境污染對發(fā)酵的威脅需要采取如下采取具體措施：
①減少活菌體排放，發(fā)酵廢液及洗罐水等處理后排放，減少噬菌和雜菌生長的機會；
②清除發(fā)酵周邊環(huán)境的衛(wèi)生死角，每天定期對發(fā)酵操作面進(jìn)行清洗，確保無積水和沉積污物。根據(jù)雜菌(噬菌體)的檢測結(jié)果(噬檢1次／d，雜檢1次／3d)，有針對性或不定期采用消毒水或漂白粉等對發(fā)酵環(huán)境進(jìn)行消毒處理，以降低雜菌的密度。
發(fā)酵過程的無菌驗證是必不可少的，因為所有無菌系統(tǒng)及操作，最終是為了保證發(fā)酵生產(chǎn)的正常進(jìn)行，而出現(xiàn)染菌的事件依然會發(fā)生。在發(fā)酵過程中，微生物檢驗人員應(yīng)定期取樣進(jìn)行培養(yǎng)分析，監(jiān)控可能的異常，提前預(yù)警可能的染菌情況，為生產(chǎn)提供必要的指導(dǎo)。隨著生物工程技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，發(fā)酵工程的應(yīng)用不斷增加，發(fā)酵過程無菌系統(tǒng)的保證不僅是提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本，對于產(chǎn)品食品安全也是一個有效的保證。
|
如何保證發(fā)酵無菌系統(tǒng)
